流式细胞术如何工作？

流式细胞术是一种用于检测和测量细胞或颗粒群的物理和化学特征的技术。 在此过程中，含有细胞或颗粒的样品悬浮在液体中并注入 流式细胞仪  仪器中。 

流式细胞术的目的是什么？ 

流式细胞术提供了一种成熟的方法来识别溶液中的细胞，最常用于评估外周血、骨髓和其他体液。 流式细胞术研究用于识别和量化免疫细胞并表征血液恶性肿瘤。  他们可以测量： 

• 细胞大小
• 细胞粒度
• 总DNA 
• 新合成的 
• DNA基因表达
• 表面受体
• 细胞内蛋白质
• 瞬态信号

在非常快的时间跨度内执行这些测量的能力是流式细胞术过程的关键优势之一。 它们可以在不到一分钟的时间内对单个样品中的多达三到六种特性或成分进行定量，逐个细胞地定量大约 10,000 个细胞。

流式细胞术仪器和方法

流式细胞仪吸入单分散的单个、未成团的细胞悬浮液，一次一个（单列）通过激光束，其中每个细胞都穿过激光束、散射光和荧光，然后进行计数和分类或进一步表征。 

流式细胞仪的三个主要组件是流体、光学和电子器件。

• 流式细胞仪的流体系统负责将样品从样品管输送到流动池，经过激光、分类和/或丢弃。
• 光学系统的组件包括激发光源、透镜和滤光片，用于收集和移动仪器周围的光波长以及产生光电流的检测系统。 数据中波长响应的差异有助于分析细胞类型。
• 电子或流式细胞仪仪器。

使用流式细胞术的主要原理之一是能够分析完整的细胞周期并分析不同阶段的 DNA 含量。 监测细胞周期的自然事件可以为疾病诊断和治疗预后提供信息。细胞周期的不同阶段可以揭示 DNA 含量的改变和其他异常，表明肿瘤的存在或晚期细胞死亡的迹象。 数据表达式通过与分析期间所选仪器使用相关的专用流式细胞术软件存储在计算机中。  流式细胞术数据通常以两种不同的方式报告： 直方图和/或点图 。

流式细胞仪

荧光激活 细胞分选 (FACS) 是一种特殊类型的流式细胞术。它提供了一种根据每个细胞的特定光散射和荧光特性将生物细胞的异质混合物分选到两个或多个容器中的方法，一次一个细胞。 它与流式细胞术的不同之处在于，它提供独特的表征，而不是仅仅对细胞进行计数和分选。这两种原理通常在共同表征类型的过程中发挥作用，为流式细胞术分析提供完整的定性和定量方法。 

流式细胞术过程：  

细胞悬浮液被夹带在狭窄、快速流动的液体流的中心。 流动的安排使得细胞之间相对于其直径有较大的间隔。振动机制迫使细胞流分裂成单个液滴。系统经过调整，每个液滴出现多个细胞的可能性较低。 就在液流分解成液滴之前，液流通过荧光测量站，在该测量站测量每个细胞的感兴趣的荧光特征。 

充电环正好放置在水流分裂成液滴的位置。 根据之前的荧光强度测量，将电荷放置在环上，当液滴从流中破裂时，相反的电荷被捕获在液滴上。然后带电的液滴落入静电偏转系统，静电偏转系统根据液滴的电荷将液滴转移到容器中。 在一些系统中，电荷直接施加到流上，并且分裂的液滴保留与流相同符号的电荷。 液滴分裂后，水流恢复到中性。

针对特定细胞表面蛋白的特异性抗体与荧光分子结合，然后添加到细胞混合物中。 下一步是荧光过程，而特定细胞通过激光束进行监测。根据细胞是否 具有 荧光标记抗体，包含单个细胞的液滴被分配正电荷或负电荷。 然后通过电场检测含有单个细胞的液滴，并根据其电荷转移到单独的收集管中， 从而可以轻松分离用荧光抗体标记的细胞 。

多色流式细胞仪 

在检查混合细胞群（例如人类和动物样本中的血液和组织细胞）时，多色流式细胞术是一种有用的技术。 一般来说，特定的细胞类型用荧光染料（标记物）标记，例如荧光团或碘化丙啶。 同时使用多种荧光标记的能力可以识别多种细胞类型，以及进一步表征每个样品的功能标记。 有专门的仪器能够测量 12 种以上的颜色 3,4 。 这些荧光染料和标记物通过激光发射的不同波长的光进行测量，以根据单个细胞类型进行分类。 每个标记在特定波长的光下被激发，以便在使用多个标记时区分它们。

将典型的染色面板从 4 到 6 种颜色调整为超过 12 种颜色并不是简单的“即插即用”问题，必须以系统的方式进行处理，才能在染色面板中实现成功的参数。 面板设计的基本原理最好基于使用前的研究。换句话说，即使从参考染色指数的开始过程起，准备工作就很关键，以便通过亮度 ⁵ 有效匹配荧光染料。

流式细胞仪提示：  在设计一抗面板之前，请花一些时间了解流式细胞仪的细微差别   。 重点关注可以在系统上进行最敏感测量的位置。这个故事不仅仅是荧光强度。 考虑替换亮度较低的荧光染料以避免通道错误。 

流式细胞术方法的常见应用

流式细胞术是多个临床领域不可或缺的组成部分，包括诊断、治疗计划和全身性疾病（无论是静态的还是进行性的）。 随着我们对流式细胞术实际应用的了解越来越多，知识库也进一步扩大。 现在，研究人员比以往任何时候都对能够更多地了解某些疾病和病症的复杂性感到非常兴奋。它导致诊断模式发生迅速变化，并彻底改变了治疗癌症等疾病的医疗方法   。

流式细胞术方法通常涉及其他综合测试模式，例如形态学检查。 在许多情况下，血液肿瘤描述了特定的形态变化，而流式细胞术提供了更大的特异性，并帮助病理学家扩大组织异常或其他晚期疾病的范围。在某些情况下，流式细胞术可以在检测到形态变化之前预先确定癌症的复发 。

现代临床环境中治疗和研究导向的一些主要应用包括： 

• 蛋白质表达——整个细胞，甚至细胞核
• 蛋白质翻译后修饰——包括切割和磷酸化的蛋白质
• RNA——包括 miRNA 和 mRNA 转录物
• 细胞健康状态——检测细胞凋亡或细胞死亡
• 细胞周期状态——提供强大的工具来评估 G0/G1 期细胞与 S 期、G2 或多倍体细胞，包括细胞增殖和激活分析
• 异质样品中不同细胞亚群的识别和表征，包括区分中央效应记忆细胞与耗尽的 T 细胞或调节性 T 细胞

流式细胞术的基本原理在过去十年中几乎没有变化，但该技术的应用却发生了很大的变化。 流式细胞术的基础与其主要功能是一致的，即当细胞移动经过一组固定检测器时，用激光询问流中的单个细胞或颗粒。细胞计数器越来越多地检测到更多颜色的荧光，同时具有高速分选和分析功能 ⁸ 。

流式细胞术在分子科学研究中发挥着不可或缺的作用，并持续快速发展。  市场上有多种商用流式细胞仪。 它们往往遵循相同的基本原理，但在设计以及对齐和集成其他组件的概念方面存在重要差异。