运行 RT-qPCR 实验时的主要注意事项

聚合酶链式反应 (PCR) 和逆转录定量实时 PCR (RT-qPCR) 是基本的分子技术，由于它们对特定 DNA 序列或特定 RNA 转录物或病毒基因组序列的灵敏检测，已在全球许多实验室中广泛使用. 一旦我们了解了这些技术如何检测它们的核酸靶标，它们在使用的仪器和试剂方面的独特作用就变得清晰起来。

PCR 分析可以通过以下两种方式之一进行，或者使用终点 PCR，在测量最终荧光之前完成 PCR 反应，或者使用实时 PCR 检测，在荧光发生时测量荧光（在“实时荧光”中）。 -time') 在 PCR 扩增过程中。当使用终点 PCR 时，一个简单的热循环仪就足以进行 PCR 扩增和检测。如果需要实时 PCR，则必须在实时热循环仪仪器上进行测定，因为它具有适用于测定的检测格式，并且还可以检测已知的 RNA 转录物或 RNA 中的序列。

在本概述中，我们将重点关注启用 RT-qPCR 方法的关键考虑因素和方法，因为这种新技术为非常流行的应用（如基因表达和分子和基因分型分析）提供了一定水平的灵敏和特异性检测。

仪器功能在 qPCR 检测结果中起着重要作用，并且因产品而异。热稳定性、光学系统和通量形式也会影响您的实验设置和过程。

热稳定性

系统在扩增过程中整个板的热稳定性确保您可以在板的所有孔中运行您的测定，包括板周围的外部孔。在 PCR 扩增过程中不必担心边缘效应，使整个过程更高效，移液更少，从而减少浪费。

光学系统

为了询问反应，实时热循环仪必须照亮样品并检测产生的荧光。对于一致的强度和光程，确保在所有孔中发生一致的照明和检测非常重要。在某些情况下，这可以通过将 LED/检测器对安装在扫描板上的梭子上来实现。其他光学配置，例如使用固定 LED 照亮整个板，在穿梭中使用多个 LED，或使用光纤定位来自固定 LED 的光，可能会导致边缘或角度效应、LED 强度变化、或不同的路径长度。

吞吐量

根据检测设计和可用样品数量，不同孔格式的选择可能是一个重要的考虑因素。提供 96孔板和 384孔板的产品，可适应不同的起始样品量以满足不同的应用需求。

除了仪器选择之外，强大的 qPCR 过程还包括检测设计。重要的是要考虑如何设计 qPCR 检测的每个步骤，从样品制备到检测设计本身。

单一或多重目标

检测设计包括考虑针对多个目标的单重检测与多重检测。多重检测的设计和优化更加复杂，即使您购买的是商业检测，但如果您经常使用它们，它们将提供巨大的成本和通量优势。然而，在多重 PCR 中，为 qPCR 反应提供稳健的预混液非常重要，该预混液允许扩增每个靶标，减少潜在的污染和样品间的变异性。

染料与基于探针的检测分析

qPCR 检测是否存在扩增的 DNA 可以通过两种方法测量：基于染料或探针的方法。在理想情况下，随着 DNA 的扩增，反应中存在的扩增子数量（与初始靶标数量的对数成正比）将在每个循环中翻倍。与扩增子数量成正比的荧光强度也随之翻倍。

当嵌入染料（例如 SYBR 和 EvaGreen）与核酸结合时，它们会导致核酸发出荧光，因此可检测到。它们价格低廉，需要相对简单的分析设计来优化 qPCR 反应。由于染料本身不是序列特异性的，并且会与任何双链 DNA 结合，因此有必要进行熔点曲线分析，以确保该测定仅扩增了单个产物。

荧光标记的探针，例如 TaqMan，依赖于与特定目标区域结合的序列特异性探针，从而产生荧光。与嵌入染料相比，基于探针的分析更昂贵且设计复杂，但是，它们提供了一种特异性，使它们能够询问与其他序列非常相似的目标。它们也可以多路复用，允许在单个反应中检测多个目标。

试剂选择和制备

反应所需的试剂通常以超级混合物的形式出售，其中包含聚合酶、dNTP、阳离子、缓冲液和其他 PCR 反应中常用的添加剂。聚合酶是 DNA 复制所必需的酶，从原始 DNA 模板产生相同的 DNA 链拷贝。

标准的 DNA 聚合酶——已经比原来的 Taq 先进得多——足以满足大多数 qPCR 应用。但对于难以扩增的样品——例如那些具有高 GC 含量、基质中抑制剂浓度高、二级结构或长扩增子的样品——最好使用先进的、高度稳健、高度加工的聚合酶工程为目的。

从超混合液制备主混合液可实现一致的试剂混合液，节省时间，同时减少移液、污染可能性和样品间变异性。如果适用，使用专门用于基于染料或基于探测的化学的混合物非常重要。

技术复制

一般来说，运行技术重复和平均 Cq 值将允许采样技术的更好再现性。在以下情况下，这可以看作是有益的：

减少处理低丰度样品时出现的子采样错误，因为随着这些目标浓度的降低，获取一致数量目标的能力会降低，从而难以生成准确的标准曲线。

测量不确定性还来自样品中的目标量低。在这里，尽管每个移液样品中可能有相同数量的靶标，但由于反应的随机性，在初始循环期间只有一部分靶标分子被扩增至完成，从而影响后续循环作为级联效应。样品浓度越低，变异性就越大。

结论

请注意有关仪器选择和分析计划的这些关键考虑因素，这将使您的 qPCR 分析获得最可靠的数据，从而节省您的时间和额外的精力。